近日，我所生物分離分析新材料與新技術研究組（1809組）葉明亮研究員、秦洪強研究員團隊與中科院上海藥物所黃蔚研究員團隊合作，提出并構建了O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）糖肽的可逆酶促化學標記策略，并與親水作用色譜富集方法相結合，實現了O-GlcNAc糖基化的高靈敏度檢測，為生物樣品中蛋白質O-GlcNAc糖基化的高覆蓋度檢測提供了一種簡便有效的手段。
O-GlcNAc修飾主要發生在絲氨酸或蘇氨酸（Ser/Thr）的殘基，是一種重要的蛋白質翻譯后修飾（PTM），參與調控細胞代謝、信號轉導、免疫應答等生理過程。由于O-GlcNAc的低豐度、高度動態變化性，極大地增加了富集與分析的難度。目前，現有的抗體等非共價作用富集策略存在親和力低、富集效率低等問題；化學酶促標記法等富集策略雖然顯著提高了糖肽富集的特異性，但是該策略引入大質量標簽，降低了糖肽的鑒定效率。
針對上述問題，合作團隊發展了一種可逆標記的無損富集檢測策略。在該策略中，科研人員首先利用糖苷內切酶突變體Endo-M N175Q的轉糖酶連接活性，將N-糖鏈基團連接到O-GlcNAc糖單元，從而提高O-GlcNAc糖肽的親水性；接著，基于延長糖鏈的親水性，采用親水作用色譜方法對O-GlcNAc標記糖肽進行富集；最后，利用野生型糖苷內切酶Endo-M/S的水解活性，將富集后糖肽中的標記糖鏈釋放，實現O-GlcNAc糖肽的無痕富集，避免了標記糖鏈對O-GlcNAc糖肽鑒定效率的影響，以此實現了O-GlcNAc糖肽的無損富集與檢測。
合作團隊將該方法應用于HeLa細胞核蛋白質O-GlcNAc糖基化的分析，從1.1mg蛋白樣品中共鑒定到1414處潛在O-GlcNAc糖基化位點，其中637處（約45%）未在人源O-GlcNAc糖基化數據庫中收錄（1985-2020年），豐富了O-GlcNAc糖蛋白組基礎數據。本工作鑒定到的O-GlcNAc糖蛋白中，包括識別RNA上N6-甲基腺苷（m6A）的YTHDF1和YTHDF3蛋白，以及與之形成相互作用網絡的另外13種蛋白，后者與劇烈條件下應激小體的形成密切相關，為應激小體形成與蛋白質O-GlcNAc之間的作用機制研究提供了新線索。
相關研究成果以“Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach Enables Reversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis”為題，發表在《德國應用化學》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。該工作的共同第一作者是我所1809組博士研究生陳堯和中科院上海藥物所唐峰博士。上述工作得到國家自然科學基金、國家重點研發計劃、我所創新基金、中科院青促會等項目的資助。（文/圖 秦洪強）
